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LES SYSTÈMES CELL-FREE NE SONT PERTINENTS QUE POUR LES PROTÉINES MEMBRANAIRES

Mar 26, 2022 | Biomythes Cell-Free

Les systèmes cell-free offrent des avantages par rapport aux systèmes
d’expression in vivo pour les protéines difficiles à exprimer, non seulement
pour les protéines membranaires, mais tout autant pour les protéines ayant des
ponts disulfures multiples, les protéines instables, agrégées ou les protéines
cytotoxiques.

En effet, les protéines qui sont toxiques pour la cellule hôte de production,
sont souvent difficiles à exprimer à des rendements élevés. Les systèmes
d’expression cell-free sont une solution efficace à ce problème, car ils
s’affranchissent de la croissance et de la viabilité des cellules, nécessaires à
l’expression de protéines dans les systèmes cellulaires. Ainsi, le système
cell-free permet, par exemple, la production de protéines cytotoxiques d’intérêt
thérapeutique contre le cancer, telles que les immunotoxines à base d’exotoxines
de Pseudomonas (PE), ciblant les antigènes tumoraux exprimés dans divers cancers
(Weldon et al., 2011 ; Wolf et al., 2009).


LES SYSTÈMES D’EXPRESSION CELL-FREE APPORTENT DES SOLUTIONS POUR LA PRODUCTION
DE PROTÉINES MEMBRANAIRES AU MÊME TITRE QUE POUR LES PROTÉINES INSTABLES,
CYTOTOXIQUES OU ENCORE AGRÉGÉES.

Les peptides et protéines antimicrobiens peuvent également être exprimés dans
des systèmes cell-free, alors qu’ils induisent la mort ou l’inhibition de la
croissance bactérienne dans les systèmes E. Coli (Jin et al., 2018).

Concernant la production de protéines transmembranaires fonctionnelles, celle-ci
peut être grandement améliorée grâce à la nature « ouverte » du système
cell-free, qui permet un contrôle unique et une adaptation spécifique de
l’environnement de synthèse, en complétant les composants clés pour une protéine
donnée, à des concentrations précises. Une telle adaptation n’est pas possible
dans les systèmes in vivo. (Jin et al., 2018).

A titre d’exemple, la formation de ponts disulfures est favorisée en optimisant
les conditions redox et en ajoutant des chaperonnes et des isomérases (Carlson
et al., 2012 ; Rosenblum et al., 2014). L’agrégation des protéines in vitro peut
également être évitée par l’ajout d’agents stabilisants, tels que des
polyéthylène glycols, des polysaccharides ou certains acides aminés (Kai et al.,
2013).

Ainsi, les systèmes d’expression cell-free ont été largement exploités pour
produire des protéines transmembranaires qui constituent la classe la plus
importante de cibles thérapeutiques. En raison de leurs structures complexes et
de leurs domaines transmembranaires hydrophobes, ces protéines sont difficiles à
exprimer dans les systèmes in vivo.

En revanche, les systèmes « ouverts » cell-free offrent la souplesse nécessaire
pour incorporer dans le milieu réactionnel des détergents ou des lipides qui
miment les structures membranaires et aident ainsi à solubiliser les protéines
membranaires (Carlson et al., 2012 ; Jin et al., 2018).

Comme ces dernières se comportent différemment des autres classes de protéines,
le criblage d’expression systématique de l’environnement est important, à
commencer par le criblage de détergents. Cependant, de nombreuses protéines
membranaires ne se replient pas correctement en présence de détergent et ont
besoin d’un environnement lipidique spécifique pour adopter leur repliement
fonctionnel et leur stabilité. Aussi, des bicouches lipidiques préformées et de
composition lipidique précise, apportées sous forme de liposomes ou de
nanodisques, peuvent être ajoutées à l’extrait cellulaire pour être présentes
lorsque ce type de protéines à domaines transmembranaires hydrophobes est à
exprimer (Henrich et al., 2015).

> À titre d’exemple, Synthelis a produit plus de 150 protéines membranaires,
> dont une vingtaine de GPCR sous forme de protéoliposomes, en utilisant sa
> technologie brevetée d’expression cell-free en présence de liposomes. Il en
> résulte que la majorité des GPCR exprimés par cette approche, présentent un
> repliement fonctionnel, attesté par SPR, par méthode ELISA, par
> interférométrie et/ou par test de liaison du radio-ligand.

Ainsi, le récepteur à chimiokine C-X-C de type 4 (CXCR4) a été produit par
Synthelis en quantité allant jusqu’à 10 mg dans un format protéoliposome. Le
repliement correct de la protéine CXCR4 a été validé par SPRi (SPRiPlex, Horiba)
et BLI (Octet RED96, Pall – Fortebio) avec 4 ligands différents (CXCL12, T22,
AMD 3100 et l’anticorps conformationnel 12G5). Des campagnes d’immunisation ont
ensuite été menées avec succès chez le lama ainsi que chez la souris à l’aide de
ces protéoliposomes contenant le récepteur CXCR4 bien conformé.
Des anticorps murins liant spécifiquement le récepteur CXCR4 ont ainsi été
obtenus par la société Fair Journey Biologics, qui a pu valider cette
spécificité par cytométrie en flux contre des cellules HEK293 surexprimant ce
RCPG.

L’équipe BIOS de l’unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements
(PRC) du centre INRA de Nouzilly a, quant à elle, pu sélectionner un nanobody
ayant un fort effet antagoniste sur CXCR4 à partir de leur banque immune issue
du lama immunisé. Pour ce faire, ils ont également utilisé les protéoliposomes
CXCR4 dans la phase de panning de leur processus de phage display.

De manière similaire, il a été démontré que les nanodisques permettent
l’insertion de récepteurs couplés à la protéine G (GPCR) (Gao et al., 2012 ;
Proverbio et al., 2013) lorsque des nanodisques avec une composition lipidique
appropriée, sont intégrés dans un système cell-free.

> Ainsi, comme le montre cet article, corroboré par une liste croissante de
> publications scientifiques, la puissance des systèmes cell-free réside dans
> leur capacité à repousser les limites biologiques des cellules et à pouvoir
> exprimer tout type de protéines dont les plus difficiles, non seulement celles
> intégrées aux membranes plasmiques, mais aussi les protéines cytotoxiques,
> complexes, instables ou insolubles.

Prendre RDV$

AUTHORS & SOURCES

Carlson E.D., Gan R., Hodgman C.E., Jewett M.C. 2012. Cell-free protein
synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances 30:1185–1194.

Henrich E., Hein C., Dötsch V., Bernhard F. 2015. Membrane protein production in
Escherichia coli cell-free lysates. FEBS Letters 589:1713–1722.

Gao T., Petrlova J., He W., Huser T., Kudlick W., Voss J., Coleman M.A. 2012.
Characterization of de novo synthesized GPCRs supported in nanolipoprotein
discs. PLoS One 7(9), e44911.

Isaksson L., Enberg J., Neutze R., Karlsson B.G., Pedersen A. 2012. Expression
screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein
Expression and Purification 82:218–225.

Jin X., Hong S.H. 2018. Cell-free protein synthesis for producing
‘difficult-to-express’ proteins. Biochemical Engineering Journal 138:156–164.

Kai, L., Dötsch, V., Kaldenhoff, R., Bernhard, F. 2013. Artificial environments
for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins. PLoS ONE
8(2): e56637.

Proverbio D., Roos C., Beyermann M., Orbán E., Dötsch V., Bernhard F. 2013.
Functional properties of cell-free expressed human endothelin A and endothelin B
receptors
in artificial membrane environments. Biochim. Biophys. Acta 1828(9):2182–2192.

Rosenblum G. and Cooperman, B.S. 2014. Engine out of the chassis: Cell-free
protein
synthesis and its uses. FEBS Letters 588:261–268.

Weldon J.E., Pastan I. 2011. A guide to taming a toxin: recombinant immunotoxins
constructed from Pseudomonas exotoxin A for the treatment of cancer, FEBSJ.
278:4683–4700.

Wolf P., Elsässer-Beile U. 2009. Pseudomonas exotoxin A: from virulence factor
to
anti-cancer agent, Int. J. Med. Microbiol. 299:161–176.




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